El papel de HPLC en detección y caracterización de virus
HPLC es una técnica consolidada para la cuantificación y caracterización de partículas virales en el desarrollo de vacunas, en la identificación y caracterización de proteínas correspondientes serotipos virales al analizar la epidemiología de la enfermedad. 1-3 ¿Cómo funcionan estas técnicas y cómo podemos asegurarnos de que son tan precisas como sea posible con respecto a su disolvente más importante? ¿Agua ultrapura?
Los virus son organismos que no tienen una célula, su estructura está formada básicamente por proteínas y ácido nucleico (ADN, ARN o ambos). La proteína forma una concha llamada cápside. Los virus solo pueden multiplicarse dentro de las células vivas de un huésped. Los virus a menudo se denominan erróneamente “vivos” aunque el término correcto es “activo” porque son parásitos que no pueden sobrevivir en su forma “activa” fuera del organismo huésped. Son mucho más pequeños que las bacterias. 4 Por ejemplo, con un diámetro de 220 nm, el virus del sarampión es aproximadamente 8 veces más pequeño que un coli, y la familia de los coronavirus es aún más pequeña, con un diámetro promedio de aproximadamente 120 nm. 5
La cápside viral tiene proteínas características, que pueden desencadenar una respuesta inmune en el organismo huésped, con el fin de eliminar el virus, antes de comenzar su enfermedad asociada, y propagarse a través de gotitas contaminadas, por la población huésped. 6 Se susurra la palabra “mutación”, refiriéndose a pequeños cambios en estas proteínas de la cápside o el recubrimiento, que permiten que un cierto virus no sea detectado por el sistema inmune y continúe su proliferación en el cuerpo del huésped, por ejemplo: el virus de la “gripe” muta con tanta frecuencia que se debe de desarrollar una nueva vacuna cada año, con investigadores destacados epidemiólogos, sobre las cepas que prevalecerán en una región específica en un año determinado. (Fig. 1).7
Figura 1. Este mapa de la OMS muestra la prevalencia de las cepas de influenza en Europa en la semana 49 de 2019 y demuestra lo difícil que puede ser predecir y recomendar una vacuna común para una temporada determinada.
Una razón por la cual las técnicas de HPLC y LC / MS son tan útiles para la caracterización del virus, es que evitan la necesidad de generar anticuerpos específicos y el desarrollo de pruebas ELISA: las proteínas virales, o partes de ellas, conocidas como péptidos, son simplemente separado en una columna de HPLC y analizado por espectrometría de masas.8,9
La naturaleza y el grado de separación de las partes componentes de la cubierta de proteína viral, pueden proporcionar una indicación de la estructura del virus y son tan precisos que se pueden detectar serotipos separados, como se puede ver en el caso del virus de la gripe.1
Por lo tanto, la técnica de HPLC puede considerarse fundamental en la investigación de brotes de enfermedades, permitiendo la caracterización de las especies y subespecies de un virus, encontradas en pacientes individuales, y para la construcción de mapas epidemiológicos detallados. Dichos mapas se construyen continuamente para monitorear enfermedades como la influenza en todo el planeta.10
No solo los virus pueden caracterizarse de esta manera. HPLC y LC / MS también se pueden usar para determinar las huellas digitales moleculares específicas de diferentes subespecies de bacterias, que son particularmente importantes cuando se trata de rastrear las fuentes de infecciones nosocomiales y la resistencia a los antibióticos.11,12
Cuando se trata de detectar y cuantificar proteínas o péptidos presentes en una muestra de paciente dada, que se pueden extrapolar para cuantificar la carga viral y caracterizar el subtipo viral específico, HPLC y LC / MS a menudo trabajan en los límites de detección, por lo que, es extremadamente importante que los solventes utilizados en la preparación de las muestras y en los análisis cromatográficos sean lo más puros posible. Esto incluye agua purificada, utilizada para preparar muestras y tampones a lo largo del flujo de trabajo. El uso de agua ultrapura evitará problemas tales como picos fantasmas que interfieren con un cromatograma, lo que podría generar un resultado falso positivo.14 La importancia del agua ultrapura cuando se trabaja dentro de los límites de detección de HPLC y LC / MS se explica con más detalle en nuestro “White Paper”, donde analizamos con mayor profundidad el desarrollo de pruebas optimizadas para diferentes aplicaciones, como el monitoreo de medicamentos terapéuticos y toxicología forense.
Vacunación: Cómo se usa la HPLC en la fabricación de vectores virales
Anteriormente vimos cómo los ensayos de HPLC y LC / MS se desarrollaron y optimizaron de manera efectiva para la cuantificación y caracterización de virus y bacterias durante la investigación de la epidemiología de enfermedades específicas. Esto plantea una pregunta: ¿es posible utilizar HPLC para detectar virus en cantidades tan bajas e incluso caracterizar sus subespecies individuales? ¿Puede la HPLC también ser útil en el desarrollo de vacunas basadas en virus?
Ningún historial de desarrollo de vacunas basadas en virus estaría completo sin rendir el debido homenaje a Edward Jenner, considerado el fundador de la vacuna cuando, en 1796, inoculó a un niño de 13 años con el virus de la vacuna (viruela) y demostró inmunidad a viruela. En 1798, se desarrolló la primera vacuna contra la viruela. Las siguientes vacunas recomendadas no se desarrollaron hasta principios del siglo XX.16 Incluyeron vacunas que protegen contra la tos ferina (1914), la difteria (1926) y el tétanos (1938), las tres se combinaron en 1948 y se administraron como una vacuna DTaP o triple vacuna bacteriana.15 La vacuna contra la polio se autorizó en 1955, en 1963 se desarrolló la vacuna contra el sarampión y, a fines de la década de 1960, también estaban disponibles las vacunas para la protección contra las paperas (1967) y la rubéola (1969).15 Estas tres vacunas se combinaron en la vacuna MMR / SCR o vacuna triple viral en 1971.15
En las últimas décadas del siglo XX, a medida que la biología molecular se desarrolló y evolucionó, primero para la ciencia y luego para la herramienta de rutina, los científicos comenzaron a estudiar cómo las partículas virales secuestran la maquinaria genética de la célula humana y analizan posibilidad de usarlos para desarrollar nuevas vacunas. ¿Qué pasaría si pudieran atenuar partículas virales específicas y usarlas como un medio para introducir ácidos nucleicos recombinantes en el cuerpo humano? ¿Qué pasaría si pudieran hacer que el cuerpo produzca las proteínas correspondientes a estos ácidos nucleicos y, por lo tanto, provoque una respuesta inmune para inmunizar contra la enfermedad? Y nació la idea de los vectores virales.
Debido a que pueden inducir efectivamente respuestas inmunes humorales y mediadas por células, los vectores virales son una gran alternativa a las plataformas tradicionales para proporcionar antígenos de vacunas correspondientes a enfermedades específicas, así como para atacar y matar específicamente las células cancerosas. Los beneficios resultantes de la aplicación exitosa de vectores virales para prevenir y tratar enfermedades humanas son potencialmente enormes. De hecho, este es el enfoque prometedor utilizado en laboratorios de todo el mundo en la carrera para encontrar vacunas contra cualquier número de enfermedades, incluido el último coronavirus, SARS-CoV-2 o COVID-19.16
El adenovirus es un vector viral común que se considera un caballo de batalla cuando se trata de desarrollar estas vacunas recombinantes que suenan ambiciosas.17 Los adenovirus han sido ampliamente estudiados por su uso potencial en aplicaciones de terapia génica. Debido a años de investigación, se ha establecido una base para el uso de este virus de ADN de doble cadena lineal como vector para la administración de vacunas, los adenovirus se han convertido en uno de los vectores más explotados para el desarrollo de vacunas.
Las principales ventajas de usar el adenovirus como plataforma de vacuna incluyen la capacidad de infectar una amplia variedad de huéspedes e inducir altos niveles de expresión transgénica, sin la posibilidad de que los genes virales se integren en el genoma del huésped. Es importante tener en cuenta que, debido a su capacidad para crecer a altos títulos en cultivo celular, los adenovirus pueden fabricarse de manera segura y a bajo costo.17
Tomemos un ejemplo de esta investigación en el Reino Unido. Tan pronto como la secuencia genómica del coronavirus 2 para el síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) estuvo disponible a mediados de enero, el equipo de Sarah Gilbert en Oxford comenzó a trabajar en el diseño de una vacuna, utilizando técnicas de ADN recombinante para crear un antígeno SARS-CoV-2 e incorporarlo en un vector de adenovirus de primates. La vacuna contiene la secuencia genética de la proteína "espiga" que se encuentra en el exterior del coronavirus. Después de la vacunación, se produce la proteína de la superficie máxima del coronavirus, que induce al sistema inmunitario a atacar el coronavirus si luego infecta el cuerpo. Se eligió un vector de vacuna de adenovirus de chimpancé (ChAdOx1) como la tecnología de vacuna más adecuada para una vacuna de SARS-CoV-2. Esto se debe a que puede generar una fuerte respuesta inmune a partir de una dosis y no es un virus replicante, por lo tanto, no puede causar una infección continua en el individuo vacunado. Esto también lo hace más seguro para los niños, los ancianos y cualquier persona con una afección preexistente, como la diabetes. Las pruebas para esta vacuna comienzan en mayo de 2020, con la posibilidad de que una vacuna esté disponible más adelante en el año.
Las técnicas de HPLC y LC / MS no solo se utilizan para caracterizar proteínas recombinantes producidas por vectores virales, sino que también son técnicas esenciales en todo el flujo de trabajo de fabricación de vacunas, donde se utilizan para la cuantificación y el control de calidad, además de gel y métodos PCR. Los pasos involucrados en la purificación de adenovirus son (1) lisis celular y descomposición del ADN genómico, (2) purificación, (3) concentración de ultrafiltración / diálisis, (4) purificación de intercambio aniónico, (5) filtración en gel y ( 6) microfiltración18.La HPLC se puede utilizar para el control de calidad de cualquiera o todas las etapas y es particularmente importante para garantizar la eliminación de todos los contaminantes al final del proceso, donde funcionará dentro de los límites de detección.
Conclusión
No se puede subestimar la importancia de los ensayos de HPLC y LC / MS de alta calidad para combatir la enfermedad, ya sea caracterizando una enfermedad en primer lugar o monitoreando la producción de vacunas destinadas a su posible cura. A menudo usamos HPLC en los niveles extremos del límite de detección, ya sea de partículas / proteínas virales o de contaminantes en las vacunas. Siempre debemos asegurarnos de que se use agua ultrapura de calidad en todas las etapas de investigación y fabricación.