O Papel do HPLC na Detecção e Caracterização de Vírus
HPLC é uma técnica consolidada para a quantificação e caracterização de partículas virais no desenvolvimento de vacinas, e na identificação e caracterização das proteínas correspondentes a diferentes sorotipos virais quando analisada a epidemiologia da doença.1-3 Como essas técnicas funcionam e como podemos garantir que sejam tão precisas quanto possível no que diz respeito ao seu solvente mais importante: água ultrapura?
Vírus são organismos que não possuem célula, sendo sua estrutura formada basicamente por proteínas e ácido nucleico (DNA, RNA ou os dois). A proteína forma um envoltório denominado de capsídeo. Os vírus somente são capazes de se multiplicarem dentro das células vivas de um hospedeiro. Os vírus são frequentemente chamados, erroneamente, de "vivos", embora o termo correto seja "ativo", pois são parasitas que não conseguem sobreviver em sua forma "ativa" fora do organismo hospedeiro.4 Eles são muito menores que as bactérias. Por exemplo, com um diâmetro de 220 nm, o vírus do sarampo é cerca de 8 vezes menor que uma E.coli, e a família dos coronavírus é ainda menor, com um diâmetro médio de aproximadamente 120 nm.5
O capsídeo viral possui proteínas características, que podem desencadear uma resposta imune no organismo hospedeiro, a fim de eliminar o vírus, antes de iniciar sua doença associada, e se espalhar através gotículas contaminadas, pela população hospedeira.6 A palavra "mutação" é sussurrada em voz baixa, referindo-se às pequenas alterações nessas proteínas do capsídeo ou do revestimento, que permitem que um determinado vírus não seja detectado pelo sistema imunológico e continue sua proliferação no corpo do hospedeiro, por exemplo. o vírus da 'gripe' sofre mutações com tanta frequência que uma nova vacina deve ser desenvolvida a cada ano, com os pesquisadores liderando os epidemiologistas, sobre quais cepas prevalecerão em uma região específica em um determinado ano (Fig. 1).7
Figura 1. Este mapa da OMS mostra a prevalências das cepas do vírus influenza na Europa na semana 49 de 2019 e demonstra o quão difícil pode ser prever e recomendar uma vacina comum para uma determinada temporada.
Uma razão pela qual as técnicas de HPLC e LC/MS são tão úteis para a caracterização dos vírus é que eles evitam a necessidade de gerar anticorpos específicos e o desenvolvimento de testes ELISA: as proteínas virais, ou partes deles, conhecidas como peptídeos, são simplesmente separadas em uma coluna de HPLC e analisadas por espectrometria de massas.8,9
A natureza e o grau de separação das partes componentes do revestimento protéico viral podem fornecer uma indicação da estrutura do vírus e, são tão precisos que, os sorotipos separados podem ser detectados, como pode-se observar no caso do vírus influenza.1
Assim, a técnica de HPLC pode ser considerada como fundamental na investigação de surtos de doenças, permitindo a caracterização das espécies e subespécies de um vírus, encontradas em pacientes individuais, e para a construção de mapas epidemiológicos detalhados. Tais mapas são construídos continuamente para acompanhar doenças como a gripe em todo o planeta.10
Não são apenas os vírus que podem ser caracterizados dessa maneira. HPLC e LC/MS também podem ser usadas para determinar os “Fingerprints” moleculares específicos para diferentes subespécies de bactérias, particularmente importantes quando se trata de rastrear as fontes de infecções hospitalares e de rastrear a resistência a antibióticos.11,12
Quando se trata de detectar e quantificar proteínas ou peptídeos presente em uma determinada amostra de paciente, que pode ser extrapolada para quantificar a carga viral e caracterizar o subtipo viral específico, muitas vezes o HPLC e LC/MS estão trabalhando nos limites de detecção, portanto, é de extrema importância que os solventes utilizados na preparação das amostras e nas próprias corridas cromatográficas sejam o mais puro possível. Isso inclui a água purificada, utilizada para preparar amostras e tampões durante todo o fluxo de trabalho. O uso de água ultrapura evitará problemas como picos fantasmas interferindo em um cromatograma, o que poderia gerar um resultado falso positivo.14 A importância da água ultrapura ao trabalhar nos limites da detecção por HPLC e LC/MS é explicado em mais detalhes em nosso White Paper, onde analisamos com mais profundidade o desenvolvimento de ensaios otimizados para diversas aplicações, como monitoramento de medicamentos terapêuticos e toxicologia forense.
Vacinação: Como a HPLC é usada na fabricação de vetores virais
Vimos acima como os ensaios de HPLC e LC/MS foram efetivamente desenvolvidos e otimizados para a quantificação e caracterização de vírus e bactérias durante a pesquisa da epidemiologia de doenças específicas. Isso levanta uma questão: é possível usar o HPLC para detectar vírus em quantidades tão baixas e até caracterizar suas subespécies individuais? O HPLC também pode ser útil no desenvolvimento de vacinas baseadas em vírus?
Nenhuma história de desenvolvimento de vacinas com base em vírus estaria completa sem prestar uma devida homenagem a Edward Jenner, considerado o fundador da vacinologia quando, em 1796, inoculou um menino de 13 anos com vírus da “vaccinia” (varíola) e demonstrou imunidade à varíola. Em 1798, a primeira vacina contra varíola foi desenvolvida. As próximas vacinas recomendadas não foram desenvolvidas até o início do século XX.16 Elas incluíam vacinas que protegem contra a Coqueluche (1914), Difteria (1926) e Tétano (1938), todas as três combinadas em 1948 e administrada como vacina DTaP ou Vacina Tríplice Bacteriana.15 A vacina contra a Poliomielite foi licenciada em 1955, em 1963 a vacina contra o Sarampo foi desenvolvida e, no final da década de 1960, também estavam disponíveis vacinas para proteção contra Caxumba (1967) e Rubéola (1969).15 Essas três vacinas foram combinados na vacina MMR/SCR ou Vacina Tríplice Viral, em 1971.15
Nas décadas finais do século XX, à medida que a biologia molecular se desenvolveu e evoluiu, primeiro para a ciência e depois para a ferramenta de rotina, os cientistas começaram a estudar como as partículas virais sequestram a maquinaria genética da célula humana e a analisar a possibilidade de usá-los para desenvolver novas vacinas. E se eles pudessem atenuar partículas virais específicas e usá-las como um meio de introduzir ácidos nucleicos recombinantes no corpo humano? E se eles pudessem fazer com que o corpo produzisse as proteínas correspondentes a esses ácidos nucleicos e, assim, provocasse uma resposta imune, para imunizar contra doenças? E nasceu a idéia de vetores virais.
Como eles podem efetivamente induzir respostas imunes humorais e mediadas por células, os vetores virais são uma ótima alternativa às plataformas tradicionais para fornecer antígenos vacinais correspondentes a doenças específicas, além de direcionar e matar especificamente células cancerígenas. Os benefícios resultantes da aplicação bem-sucedida de vetores virais para prevenir e tratar doenças humanas são potencialmente enormes. De fato, esta é a abordagem promissora usada em laboratórios de todo o mundo na corrida para encontrar vacinas contra qualquer número de doenças, incluindo o mais recente coronavírus, SARS-CoV-2 ou COVID-19.16
O adenovírus é um vetor viral comum que é considerado um cavalo de batalha quando se trata de desenvolver essas vacinas recombinantes que soam ambiciosas.17 Os adenovírus têm sido extensivamente estudados para seu uso potencial em aplicações de terapia gênica. Devido a anos de pesquisa, se estabeleceu uma base para o uso desse vírus de DNA linear de fita dupla como vetor para entrega de vacinas, os adenovírus se tornaram um dos vetores mais explorados para o desenvolvimento de vacinas.
As principais vantagens de usar o adenovírus como plataforma de vacina incluem a capacidade de infectar uma ampla variedade de hospedeiros e de induzir altos níveis de expressão do transgene, sem que o potencial de genes virais seja integrado ao genoma do hospedeiro. É importante ressaltar que, devido à sua capacidade de crescer em altos títulos na cultura celular, os adenovírus podem ser fabricados com segurança e baixo custo.17
Vamos dar um exemplo dessa pesquisa no Reino Unido. Assim que a sequência genômica do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) se tornou disponível em meados de janeiro, a equipe de Sarah Gilbert em Oxford começou a trabalhar para projetar uma vacina, usando técnicas de DNA recombinante para criar um antígeno do SARS-CoV-2 e incorporando-o a um vetor de adenovírus de primata. A vacina contém a sequência genética da proteína "spike" encontrada na parte externa do coronavírus. Após a vacinação, é produzida a proteína de pico de superfície do coronavírus, que induz o sistema imunológico para atacar o coronavírus se mais tarde infectar o corpo. Um vetor de vacina adenovírus chimpanzé (ChAdOx1) foi escolhido como a tecnologia de vacina mais adequada para uma vacina SARS-CoV-2. Isso ocorre porque pode gerar uma forte resposta imune a partir de uma dose e não é um vírus replicante, portanto, não pode causar uma infecção contínua no indivíduo vacinado. Isso também torna mais seguro para crianças, idosos e qualquer pessoa com uma condição pré-existente, como diabetes. Os testes desta vacina começam em maio de 2020, com a possibilidade de uma vacina estar disponível no final do ano.
As técnicas de HPLC e LC/MS não são usadas apenas na caracterização das proteínas recombinantes produzidas por vetores virais, mas também são técnicas essenciais em todo o fluxo de trabalho de fabricação da vacina, onde são usadas para quantificação e controle de qualidade, além de gel e PCR. métodos. As etapas envolvidas na purificação do adenovírus são (1) lise celular e quebra do DNA genômico, (2) purificação, (3) concentração com ultrafiltração/diálise, (4) purificação por troca aniônica, (5) filtração em gel, e (6) microfiltração.18 A HPLC pode ser usada para o controle de qualidade de qualquer uma ou de todas as etapas e é particularmente importante para garantir a remoção de todos os contaminantes no final do processo, onde estará trabalhando nos limites da detecção.
Conclusão
A importância de ensaios de HPLC e LC/MS de alta qualidade em no combate à doença não pode ser subestimada, seja caracterizando uma doença em primeiro lugar ou monitorando a produção de vacinas direcionadas à sua cura potencial. Muitas vezes, usamos HPLC nos níveis extremos do limite de detecção, seja de partículas/proteínas virais ou de contaminantes nas vacinas. Devemos sempre garantir que a água ultrapura de qualidade seja usada em todas as etapas da pesquisa e fabricação.