Avanço da filtragem no ponto de uso

Avanço da filtragem no ponto de uso

A ELGA removeu o requisito de que seus sistemas fossem equipados com dispositivos de tratamento no ponto de uso para atingir as especificações de RNase e DNase. Essa alteração foi feita à luz de anos de experiência para reduzir ainda mais os requisitos de manutenção e os custos de operação de nossos produtos para os usuários e reduzir o impacto ambiental de nossos produtos.

 

RNase e DNase: características e significância

Os ácidos nucléicos, DNA e RNA, são os mais importantes de todas as biomoléculas e são de particular interesse em muitas técnicas analíticas; Como são encontrados em todas as células vivas, o estudo dessas moléculas tem uma aplicação muito ampla, mas pode ser propenso a interferências por ácidos nucléicos de outras fontes que não o alvo.

Além disso, as células vivas usam enzimas (DNase e RNase) para catalisar a quebra dos polímeros de ácidos nucleicos em várias funções, incluindo a reutilização ou reparo. Essas enzimas também são onipresentes e podem ser uma preocupação maior nas técnicas de análise genética aplicadas em uma ampla variedade de trabalhos de laboratório. Em tais análises, muitas vezes uma pequena quantidade de ácido nucleico de 'modelo' é copiada ou amplificada muitas vezes para gerar uma quantidade muito maior que é adequada para caracterização. Claramente, se o material do gabarito for danificado por atividade enzimática, serão criadas cópias desse material danificado, e a caracterização poderá se tornar impossível e o teste será arruinado.

Uma via para a introdução da contaminação por DNase e RNase é a água usada como meio; é necessário garantir que essa água não contenha essas enzimas. Felizmente, as características dessas moléculas significam que elas podem ser removidas da água de alimentação usando tecnologias de tratamento de água como osmose reversa ou uma combinação de irradiação com luz ultravioleta e troca de íons. Com um bom projeto do sistema, essas enzimas podem ser removidas e possíveis re-contaminações subseqüentes eliminadas.

 

Avançando na filtragem no ponto de uso

Com a crescente necessidade de evitar a contaminação da água do laboratório pela presença de nucleases, os fabricantes de equipamentos de purificação introduziram etapas adicionais de tratamento no ponto de dispensação para evitar esses possíveis problemas de contaminação da água; porém, esses acréscimos incorrem em custos adicionais para os usuários e podem influenciar na pureza orgânica, inorgânica e microbiológica da água.

 

O teste a seguir foi realizado para demonstrar a liberação de impureza desses filtros no ponto de uso:

 

Água ultrapura (resistividade 18,2 MΩ.cm, TOC <5ppbC) foi dispensada através de filtros projetados para a remoção de biomoléculas no ponto de uso. A liberação de impurezas que contribuem para o TOC (carbono orgânico total) e a resistividade reduzida foram medidas. Esse efeito foi particularmente significativo para o Ultrafiltro de alta área superficial, onde o comprometimento da pureza da água foi prolongado e ocorreu novamente em usos repetidos subsequentes do filtro de teste.

Além disso, os filtros de ponto de uso podem apresentar microvolumes água estagnada após monitores de qualidade e outras tecnologias de purificação. Eles são vulneráveis ​​à contaminação por parte dos usuários, um local potencial para proliferação bacteriana e um ponto crítico no design do sistema de purificação.

Com um bom design de equipamento, não é necessário tratamento adicional no ponto de uso, pois essas enzimas são removidas ou inativadas pelas tecnologias anteriores. Através de anos de experiência e trabalho de teste, a ELGA comprovou o design e a robustez de seus purificadores para atingir as especificações de água para DNase e RNase sem a necessidade de etapas adicionais de tratamento no ponto de dispensação.

 

Remoção e Inativação de DNase e RNase

 

Osmose Reversa (OR)

DNase e RNase são moléculas orgânicas à base de proteínas com tamanhos na região de 30.000 e 15.000 Da, respectivamente. Essas moléculas extremamente grandes não passam pela membrana dos módulos de OR utilizados nos sistemas ELGA de purificação de água laboratorial . Esses sistemas de osmose normalmente têm um limite de peso molecular (MWCO) a <300 Da, com moléculas maiores que isso retidas pelo filtro e direcionadas ao dreno. Este corte (MWCO) tem uma ordem de magnitude inferior a um ultra-filtro que geralmente é vendido para o tratamento no ponto de uso para garantir água 'livre de RNase / DNase'. O portfólio ELGA permite que, mesmo onde não esteja instalado como padrão, a osmose pode ser incorporada aos sistemas de purificação projetados para fornecer água com baixo teor de enzimas.

 

Luz UV oxidante e troca iônica

A chave para a remoção de moléculas orgânicas de qualquer tipo na purificação de água em laboratório é o uso de processos de troca de íons e luz ultravioleta. A luz UV de alta energia oxida e quebra essas moléculas, adicionando sítios carregados a elas; estes fragmentos podem subsequentemente ser retidos muito eficientemente usando resina de troca iônica. Normalmente, a luz UV de alta energia é necessária para esse processo e as unidades de purificação de água ELGA são equipadas com lâmpadas que geram comprimentos de onda de luz a 185 nm e 245 nm. A RNase, em particular, parece muito vulnerável à inativação com UV; a inativação foi demonstrada usando luz de 254nm na década de 1960 (RADIATION RESEARCH 26, 198-210 (1965)) e agora estão disponíveis produtos de tratamento especificamente para a inativação da RNase usando energia mais baixa, luzes de 275 e 365nm.

 

 

Quando a RNase e a DNase reagem com agentes oxidantes, como os radicais peróxido e hidroxila gerados pela luz de 185 nm, são gerados sítios que permitem a ligação das moléculas às resinas de troca iônica. Esses locais ativos permitem que as moléculas sejam retidas nos meios de troca iônica no equipamento de purificação de água. Os equipamentos ELGA projetados para fornecer água de baixa enzima usam UV de alta intensidade, aplicado em 185 e 254nm, seguido por filtração por troca iônica.

 

A abordagem ELGA

Os sistemas de purificação ELGA projetados para fornecer água com menor conteúdo enzimático incorporam UV de alta intensidade (185 e 254nm) para inativar as moléculas e quebrar suas estruturas, e troca iônica para remover os produtos de decomposição. Essas tecnologias têm um efeito semelhante nas bactérias e também controlam seus níveis dentro do sistema. Além disso, esses purificadores ELGA recirculam a água purificada, passando-a repetidamente através das etapas de purificação, impedindo a estagnação, e consequentemente a recontaminação.

Os testes de controle de qualidade da enzima são realizados na água usada para técnicas de biologia molecular para confirmar a adequação. Os limites de detecção dos métodos padrão são tipicamente iguais ou superiores a 10 pg/ml para DNase e 5pg/ml para RNase. Houve pouco esforço para aumentar a sensibilidade dos testes nos últimos anos e isso parece adequado para as aplicações científicas atuais.

Como as nucleases recebidas não passam pela membrana de osmose, é provável que qualquer RNase e DNase presente na água de um purificador de água de laboratório se origine das bactérias contidas nele. As bactérias sempre estarão presentes em algum grau, mas em um purificador ELGA bem projetado, mantido e fornecendo água ultrapura, pode-se esperar um TVC (traduzido do inglês, contagem total viável) da água final em <1/UFC/ml. Dado que a massa úmida de uma bactéria individual pode ser esperada em <1pg, quaisquer biomoléculas associadas individuais estarão presentes apenas em níveis muito inferiores a 1pg/ml e, portanto, dentro dos requisitos do trabalho de biologia molecular.

 

Teste de confirmação

Na ELGA, vários testes foram realizados para medir a remoção e inativação de enzimas por tratamento com UV e troca iônica, e para demonstrar a falta dessas enzimas na água purificada pelos produtos ELGA. As seções a seguir resumem parte deste trabalho que confirma as descobertas de outros.

> Inativação de 2.5Log10 RNase com UV

As soluções de RNase em água deionizada a 100 e 1000 pg/ml foram passadas através da célula de oxidação equipada com uma lâmpada UV de comprimento de onda duplo (254/185 nm) usada em equipamentos ELGA a 1 litro/min. A água do efluente foi testada e constatou-se que contém RNase a taxa <2 pg / ml.

 

Remoção de RNase por UV e troca iônica: 1.000.000 pg/ml a <2pg/ml

A RNase foi introduzida em níveis extremamente altos (1mg/litro) no reservatório de 25 litros de um purificador ELGA. O purificador passou a água através do tratamento UV e de troca iônica antes de passar por uma válvula de dispensação. Após operação por um período de 45 minutos, o conteúdo do reservatório foi drenado através da torneira e amostras regulares foram colhidas e testadas quanto à concentração de RNase. Os valores medidos estavam todos abaixo do limite de detecção de 2pg / ml.

 

Remoção de DNase por UV e troca iônica em produtos ELGA (1.000.000 a <5pg/ml)

A DNase foi introduzida no circuito de distribuição de um purificador ELGA a 1 mg/l (usando uma bomba dosadora). A solução de 'desafio' passou pelo tratamento UV e troca iônica antes de sair do purificador por meio da válvula de dispensação. Amostras da água dispensada foram colhidas e testadas quanto à concentração de DNase, retornando resultados inferiores ao limite de detecção de 5pg/ml em todos os casos.

 

Conclusão

Após a revisão da natureza das moléculas de RNase e DNase e dos testes internos, incluindo o referente à inativação por UV e retenção por resina de troca iônica, fica claro que a água efetivamente livre dessas enzimas pode ser produzida por purificadores de água de laboratório bem projetados, como os fabricados pela ELGA, usando apenas essas tecnologias de tratamento. Essas descobertas são lógicas e alinhadas com as de outros trabalhos científicos.

O uso de tratamento adicional no ponto de uso aqui é desnecessário; aumenta os custos de operação e o desperdício de plástico, pode ser significativamente prejudicial à pureza da água e contraria as diretrizes internacionais, como do CLSI para o projeto de sistemas de purificação de água. O CLSI especifica que o monitoramento da qualidade da água deve ser realizado após todas as tecnologias de purificação para garantir que a água utilizada seja da qualidade medida. Os filtros no ponto de uso são, por definição, localizados após qualquer monitoramento da qualidade da água.