Avances de filtración en el punto de uso
ELGA eliminó el requisito de que sus sistemas estén equipados con dispositivos de tratamiento en el punto de uso para cumplir con las especificaciones de RNasa y DNasa. Este cambio se realizó a la luz de años de experiencia para reducir aún más los requisitos de mantenimiento y los costos operativos de nuestros productos para los usuarios y para reducir el impacto ambiental de nuestros productos.
RNasa y DNasa: características y significado
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son los más importantes de todas las biomoléculas y son de particular interés en muchas técnicas analíticas; Como se encuentran en todas las células vivas, el estudio de estas moléculas tiene una aplicación muy amplia, pero puede ser propenso a la interferencia de ácidos nucleicos de fuentes distintas a la diana.
Además, las células vivas utilizan enzimas (DNasa y RNasa) para catalizar la descomposición de los polímeros de ácidos nucleicos en diversas funciones, incluida la reutilización o reparación. Estas enzimas también son ubicuas y pueden ser una preocupación importante en las técnicas de análisis genético aplicadas en una amplia variedad de trabajos de laboratorio. En tales análisis, a menudo se copia o amplifica muchas veces una pequeña cantidad de ácido nucleico "modelo" para generar una cantidad mucho mayor que es adecuada para la caracterización. Claramente, si el material de la plantilla se daña por la actividad enzimática, se crearán copias de ese material dañado y la caracterización puede volverse imposible y la prueba se arruinará.
Una vía para introducir contaminación por DNasa y RNasa es el agua utilizada como medio; es necesario asegurarse de que esta agua no contenga estas enzimas. Afortunadamente, las características de estas moléculas significan que pueden eliminarse del agua de alimentación mediante tecnologías de tratamiento de agua como la ósmosis inversa o una combinación de irradiación con luz ultravioleta e intercambio iónico. Con un buen diseño del sistema, estas enzimas pueden eliminarse y la posible contaminación posterior eliminada.
Avances de la filtración en el punto de uso
Con la creciente necesidad de evitar la contaminación del agua del laboratorio por la presencia de nucleasas, los fabricantes de equipos de purificación han introducido pasos de tratamiento adicionales en el punto de dispensación para evitar estos posibles problemas de contaminación del agua; sin embargo, estas adiciones generan costos adicionales para los usuarios y pueden influir en la pureza orgánica, inorgánica y microbiológica del agua.
Se realizó la siguiente prueba para demostrar la liberación de impurezas de estos filtros en el punto de uso:
Se dispensó agua ultrapura (resistividad 18,2 MΩ.cm, TOC <5ppbC) a través de filtros diseñados para eliminar biomoléculas en el punto de uso. Se midió la liberación de impurezas que contribuyen al TOC (carbono orgánico total) y la resistividad reducida. Este efecto fue particularmente significativo para el ultrafiltro de área de superficie alta, donde el deterioro de la pureza del agua se prolongó y se repitió en los siguientes usos repetidos del filtro de prueba.
Además, los filtros de punto de uso pueden presentar microvolúmenes de agua estancada después de los monitores de calidad y otras tecnologías de purificación. Son vulnerables a la contaminación por parte de los usuarios, un sitio potencial para la proliferación bacteriana y un punto crítico en el diseño del sistema de purificación.
Con un buen diseño de equipo, no se necesita ningún tratamiento adicional en el punto de uso, ya que estas enzimas son eliminadas o inactivadas por tecnologías anteriores. A través de años de experiencia y trabajo de prueba, ELGA ha probado el diseño y la solidez de sus purificadores para cumplir con las especificaciones de agua para DNasa y RNasa sin la necesidad de pasos de tratamiento adicionales en el punto de dispensación.
Eliminación e inactivación de DNasa y RNasa
Ósmosis Inversa (RO)
DNasa y RNasa son moléculas orgánicas basadas en proteínas con tamaños en la región de 30.000 y 15.000 Da, respectivamente. Estas moléculas extremadamente grandes no atraviesan la membrana de los módulos de quirófano utilizados en los sistemas de purificación de agua de laboratorio ELGA. Estos sistemas de ósmosis normalmente tienen un límite de peso molecular (MWCO) de <300 Da, con moléculas más grandes que las retenidas por el filtro y dirigidas al drenaje. Este corte (MWCO) tiene un orden de magnitud menor que un ultrafiltro que generalmente se vende para tratamiento en el punto de uso para garantizar agua 'libre de ARNasa / DNasa'. La cartera de ELGA permite que, incluso donde no se instale de serie, la ósmosis se pueda incorporar en sistemas de purificación diseñados para proporcionar agua con un bajo contenido de enzimas.
Intercambio de iones y luz UV oxidante
La clave para eliminar moléculas orgánicas de cualquier tipo en la purificación de agua de laboratorio es el uso de procesos de intercambio iónico y luz ultravioleta. La luz ultravioleta de alta energía oxida y rompe estas moléculas, añadiéndoles sitios cargados; estos fragmentos se pueden retener posteriormente de manera muy eficiente usando resina de intercambio iónico. Normalmente, se requiere luz ultravioleta de alta energía para este proceso y las unidades de purificación de agua ELGA están equipadas con lámparas que generan longitudes de onda de luz a 185 nm y 245 nm. La RNasa, en particular, parece muy vulnerable a la inactivación por UV; La inactivación se demostró usando luz de 254 nm en la década de 1960 (RADIATION RESEARCH 26, 198-210 (1965)) y los productos de tratamiento ahora están disponibles específicamente para la inactivación de RNasa usando luces de menor energía, 275 y 365 nm.
Cuando la RNasa y la DNasa reaccionan con agentes oxidantes, como el peróxido y los radicales hidroxilo generados por la luz de 185 nm, se generan sitios que permiten que las moléculas se unan a las resinas de intercambio iónico. Estos sitios activos permiten que las moléculas se retengan en el medio de intercambio iónico del equipo de purificación de agua. El equipo ELGA diseñado para proporcionar agua con bajo contenido de enzimas utiliza rayos ultravioleta de alta intensidad aplicados a 185 y 254 nm, seguido de filtración por intercambio iónico.
El enfoque ELGA
Los sistemas de purificación ELGA diseñados para proporcionar agua con un menor contenido de enzimas incorporan UV de alta intensidad (185 y 254 nm) para inactivar moléculas y romper sus estructuras, e intercambio iónico para eliminar los productos de descomposición. Estas tecnologías tienen un efecto similar sobre las bacterias y también controlan sus niveles dentro del sistema. Además, estos depuradores ELGA hacen recircular el agua depurada, pasándola repetidamente por las etapas de depuración, evitando el estancamiento y consecuentemente la recontaminación.
Las pruebas de control de calidad de la enzima se realizan en el agua utilizada para las técnicas de biología molecular para confirmar la idoneidad. Los límites de detección de los métodos estándar son típicamente 10 pg / ml para DNasa y 5 pg / ml para RNasa. Ha habido pocos esfuerzos para aumentar la sensibilidad de las pruebas en los últimos años y esto parece apropiado para las aplicaciones científicas actuales.
Dado que las nucleasas recibidas no atraviesan la membrana de ósmosis, es probable que cualquier RNasa y DNasa presentes en el agua de un purificador de agua de laboratorio se origine a partir de las bacterias contenidas en el mismo. Las bacterias siempre estarán presentes hasta cierto punto, pero en un purificador ELGA bien diseñado, mantenido y proporcionando agua ultrapura, se puede esperar un TVC (traducido del inglés, recuento total viable) del agua final en <1 / UFC / ml. Dado que se puede esperar que la masa húmeda de una bacteria individual sea <1 pg, cualquier biomolécula asociada individual solo estará presente en niveles muy por debajo de 1 pg / ml y, por lo tanto, dentro de los requisitos del trabajo de biología molecular.
Prueba de confirmación
En ELGA, se llevaron a cabo varias pruebas para medir la eliminación e inactivación de enzimas por tratamiento con UV e intercambio iónico, y para demostrar la falta de estas enzimas en el agua purificada con productos ELGA. Las siguientes secciones resumen parte de este trabajo que confirma los hallazgos de otros.
>Inactivación de 2.5Log10 RNasa con UV
Las soluciones de RNasa en 100 y 1000 pg / ml de agua desionizada se pasaron a través de la celda de oxidación equipada con una lámpara UV de doble longitud de onda (254/185 nm) usada en un equipo ELGA a 1 litro / min. Se analizó el agua efluente y se encontró que contenía RNasa a una velocidad <2 pg / ml.
Eliminación de ARNasa UV e intercambio iónico: 1.000.000 pg / ml a <2 pg / ml
Se introdujo RNasa en niveles extremadamente altos (1 mg / litro) en el depósito de 25 litros de un purificador ELGA. El purificador pasó el agua a través de un tratamiento UV e intercambio de iones antes de pasar por una válvula dispensadora. Después de operar durante un período de 45 minutos, el contenido del depósito se drenó a través del grifo y se recolectaron muestras regulares y se analizaron para determinar la concentración de RNasa. Los valores medidos estaban todos por debajo del límite de detección de 2 pg / ml.
Eliminación de ADNasa por UV e intercambio iónico en productos ELGA (1.000.000 a <5 pg / ml)
Se introdujo DNasa en el circuito de distribución de un purificador ELGA a 1 mg / l (usando una bomba dosificadora). La solución de 'desafío' se sometió a un tratamiento UV e intercambio iónico antes de salir del purificador a través de la válvula dispensadora. Se recogieron muestras del agua dispensada y se analizó la concentración de DNasa, obteniendo resultados por debajo del límite de detección de 5 pg / ml en todos los casos.
Conclusión
Después de revisar la naturaleza de las moléculas de ARNasa y ADNasa y las pruebas internas, incluida la relativa a la inactivación y retención de rayos ultravioleta por la resina de intercambio iónico, está claro que los purificadores de agua de laboratorio que funcionen bien pueden producir agua efectivamente libre de estas enzimas. diseñados, como los fabricados por ELGA, utilizando únicamente estas tecnologías de tratamiento. Estos hallazgos son lógicos y están alineados con los de otros trabajos científicos.
El uso de tratamiento adicional en el punto de uso aquí es innecesario; aumenta los costos operativos y los desechos plásticos, puede ser significativamente perjudicial para la pureza del agua y va en contra de las directrices internacionales como CLSI para el diseño de sistemas de purificación de agua. CLSI especifica que el control de la calidad del agua debe realizarse después de todas las tecnologías de purificación para garantizar que el agua utilizada sea de la calidad medida. Los filtros en el punto de uso están, por definición, ubicados después de cualquier monitoreo de la calidad del agua.