Las técnicas de PCR se utilizan ampliamente en el sector de las ciencias de la vida para amplificar el material genético, desde la investigación genómica fundamental hasta las aplicaciones biomédicas y forenses avanzadas. La necesidad de reactivos y soluciones libres de nucleasas (DNasa, RNasa) que pueden causar la degradación de los oligonucleótidos es ampliamente reconocida. Sin embargo, la influencia de otros contaminantes transmitidos por el agua rara vez se considera. Esto puede causar problemas con los resultados de la prueba, por lo que es vital que el agua se use libre de contaminantes transmitidos por el agua misma.
Introducción
El advenimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las técnicas revolucionaron la genómica a principios de la década de 1980 y los métodos basados en PCR, como la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR), ahora son esenciales en una amplia gama de aplicaciones de investigación médica y biológica.
La amplificación de ADN por PCR depende del uso de enzimas de ADN polimerasa para sintetizar moléculas de ADN bicatenario a partir de 'modelos' monocatenarios, utilizando cebadores oligonucleotídicos cortos para dirigir el gen de interés. Aunque este proceso generalmente usa ADN polimerasas termoestables, tanto la especificidad del objetivo como la eficiencia de la reacción catalizada por enzimas dependen en gran medida de las condiciones físicas (pH, temperatura, etc.) y la composición de la mezcla de reacción1. La presencia de nucleasas (enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster entre subunidades de ácido nucleico) dentro del recipiente de reacción conducirá a una interrupción grave del proceso de PCR, ya que el material genético se fragmentará rápidamente en condiciones de reacción. Por lo tanto, es vital asegurarse de que todos los reactivos y soluciones utilizados en aplicaciones de PCR estén libres de nucleasas. La necesidad de agua 'libre de nucleasas' en aplicaciones de PCR es ampliamente reconocida; sin embargo, hay varios otros contaminantes que se encuentran comúnmente en el agua que pueden evitar la amplificación de ADN2 por PCR, que incluyen:
Las bacterias
La presencia de ADN bacteriano puede conducir a resultados erróneos, particularmente para las técnicas de qPCR, así como a la amplificación de secuencias no objetivas. Además, muchas bacterias liberan nucleasas extracelulares y otras pequeñas moléculas e iones que interfieren con la polimerización del ADN.
Iones
El ADN polimerasas termoestables requieren un cofactor de magnesio (Mg2 +) para una unión efectiva al sustrato. La concentración de Mg2 + es por lo tanto crucial para la optimización de la actividad de polimerasa3. Las enzimas polimerasas también son altamente sensibles a otros cationes divalentes comunes (Cu2 +, Fe2 +, Ni2 +, etc.), que interfieren con la coordinación del cofactor e interrumpen la unión del sustrato en el sitio activo. Además, la presencia de trazas de iones de metales pesados (como el cadmio) inhibirá la actividad enzimática.
Compuestos orgánicos
Las partículas pueden causar daños a la bomba de HPLC y también pueden bloquear columnas y capilares. Este efecto es aún más significativo para los usuarios de UHPLC, ya que los tamaños de partículas muy pequeños y los diámetros reducidos de estas columnas los hacen más susceptibles al bloqueo prematuro que sus colegas de HPLC. Los coloides pueden ser absorbidos irreversiblemente en la fase de papelería, lo que resulta en un cambio en la eficiencia de separación de la columna.
Radiación ultravioleta (UV)
Como las moléculas de ADN llevan una carga negativa, otras biomoléculas cargadas negativamente en el entorno de reacción pueden interferir con la unión del sustrato al ingresar al sitio activo cargado positivamente y causar interferencia estérica, lo que conduce a una menor renovación del sustrato.
Agua purificante para PCR
La optimización de los procesos de PCR requiere el uso de agua libre de nucleasas, microorganismos, compuestos orgánicos y oligoelementos para la constitución de todos los reactivos y tampones. Para garantizar que estos contaminantes no estén presentes, agua ultrapura (Tipo I) - con resistividad de 18.2 MΩcm, bajo valor de carbono orgánico total (TOC) por debajo de 10 ppb, niveles de bacterias por debajo de 1 CFU / ml y endotoxinas por debajo de 0.01 EU / ml - es altamente recomendado para aplicaciones de PCR. ELGA PURELAB Chorus Life Science utiliza un proceso de purificación de varios pasos para producir agua de grado reactivo adecuada para PCR, que incluye:
Radiación ultravioleta (UV)
El paso del agua a través de un haz de luz ultravioleta descompone efectivamente los compuestos orgánicos, incluidas las bacterias y las moléculas bioactivas, como las nucleasas y las endotoxinas. Una longitud de onda de 185 nm oxida las macromoléculas que contienen carbono, produciendo fragmentos ionizados para su posterior eliminación por intercambio iónico, mientras que la radiación UV de longitud de onda más larga (254 nm) interrumpe la actividad de las enzimas bacterianas, evitando la replicación. Para maximizar la descomposición de las moléculas orgánicas, PURELAB Ultra Chorus Life Science utiliza una lámpara UV de espectro completo con un guante de cuarzo sintético altamente puro.
Ultrafiltración
Los ultrafiltros (UF) son dispositivos hechos de fibras capilares huecas, con un corte de peso molecular nominal de 5 KDa. Estas fibras son generalmente asimétricas, lo que maximiza la eliminación de macromoléculas por el diferencial de peso molecular, teniendo en cuenta que estas macromoléculas tienen un peso molecular superior a 5 KDa
El PURELAB Chorus Life Science de ELGA utiliza cartuchos de purificación de eliminación de iones de alta capacidad combinados con la lámpara UV y el ultrafiltro, para proporcionar de manera confiable agua pura y sin endotoxinas.
La resistividad y el TOC en tiempo real aseguran un monitoreo confiable de contaminantes orgánicos e inorgánicos y el sistema ofrece trazabilidad validada y calidad garantizada de Elga-Veolia.
Conclusión
El agua ultra resistente con alta resistividad (18.2 MΩcm) y libre de endotoxinas debe usarse para todas las aplicaciones de PCR, asegurando la amplificación optimizada de las secuencias objetivo. Además de eliminar el tiempo perdido con autoclave en los protocolos clásicos para inactivar endotoxinas.
Para obtener más información sobre tecnologías de tratamiento y soluciones para aplicaciones de ciencias de la vida, visite www.elgalabwater.com